Tissue Culture: выращивание растений в пробирке

Что такое культура тканей растений и можно ли её использовать для выращивания растений каннабиса в пробирке? Можно ли проводить микроразмножение в домашних условиях?

Культура тканей — это способ искусственного вегетативного размножения растений, в процессе которого берут живую ткань из растения (например, части листа, стебля, цветка или даже семени) и выращивают этот эксплантат в полноценное растение в стерильных условиях. Хотя с каннабисом этот процесс сложнее, чем с некоторыми другими видами растений.

Крупный план эксплантатов конопли, разрастающихся новыми побегами. Фотография доктора Хоупа Джонса.

Вышеупомянутые эксплантаты каннабиса были культивированы и выращены в маленькие растения. Теперь они будут перенесены в среду для укоренения, чтобы отрастить корни. 

Культуру тканей растений часто называют следующими синонимичными терминами:

• Микроразмножение — для него берут крошечные кусочки растений и заставляют их расти.
• Выращивание in vitro — выращивание растений в пробирке или другой подобной среде (in vitro означает «в стекле»).
• De Novo — выращивание плодородных растений из того, что обычно не растёт само по себе, например, из листьев (de novo означает «заново»).

Что такое культура тканей растений?

Культура тканей растений похожа на то, как многие гроверы берут черенок растения каннабиса и заставляют его пустить корни. Это создает генетически идентичное растение, называемое клоном. Клонировать растение каннабиса так же просто, как отрезать стебель и положить его в стакан с водой на несколько недель.

Однако культура растительной ткани позволяет вырастить гораздо меньшие кусочки живой ткани. Этот способ также можно использовать для увеличения всхожести старых семян, для полиплоидизации, устранения болезней у ценных сортов, «перезагрузки» больного материнского растения и многого другого.

Вы можете заставить кусок растения каннабиса пустить корни, получив клон исходного растения. На фото ниже черенки каннабиса, которые были клонированы в чашке с водой традиционными методами.

Культура тканей растений аналогична обычным методам клонирования, только исходные кусочки меньше, обрабатываются для удаления всех патогенов и выращиваются в пробирках в сверхчистых условиях.

Чем культура ткани растений отличается от типичных методов проращивания и клонирования?

Всё стерильно — культура тканей создает идеальные условия для роста, потому что «вручную» доставляет всё, что нужно растению, в наиболее легкой усваиваемой форме. Но эта среда ещё лучше, она чиста от бактерий и других нежелательных микроорганизмов. Вот почему вы должны стерилизовать всё, чтобы убить все нежелательные грибки, бактерии или другие микроорганизмы, прежде чем начинать такое культивирование. В противном случае они захватят кусочки растений и попросту убьют их.

Это может показаться чрезмерным, но огромный аспект успеха в культивировании тканей — правильная стерилизация. Это включает стерилизацию не только инструментов, флаконов и оборудования для переноса тканей, но и саму живую ткань растения, то есть эксплант. Каждый предмет стерилизуется подходящими для него методами. Например, инструменты обычно стерилизуют с помощью тепла или высокого давления, в то время как кусок растения (эксплант) обычно обрабатывают чем-то более щадящим, например, лёгким раствором отбеливателя или моющего средства.

Стерилизация занимает больше времени, чем любой другой этап культивирования тканей, а без этого не обойтись, потому что среда для культивирования тканей отлично подходит для растений, но ещё лучше — для микроорганизмов. Они должны быть уничтожены в самом начале, иначе они захватят вашу культуру.

Асептические условия — на каждом этапе процесса необходимо принимать меры для обеспечения полностью стерильных условий. В лаборатории создается специальная передаточная камера для прикосновения к инструментам или частям растения, которые уже стерильны. В домашних условиях это можно сделать, перевернув на бок стеклянный аквариум, промытый отбеливателем или спиртовым раствором и запечатанный пленкой или пластиком. В пластике прорезаются отверстия, через которые можно продеть руки в перчатках.

Эта стерильная среда используется каждый раз, когда вы переносите растительный материал или иным образом подвергаете стерильные вещества или инструменты воздействию воздуха и внешней среды. Вы даже можете оставить растущие растения внутри, пока они не будут готовы переместится в почву, чтобы свести к минимуму любую вероятность заражения. Чем больше шагов для достижения стерильных условий вы пропустите, тем выше вероятность того, что вы столкнетесь с проблемами, связанными с ростом нежелательных микробов и уничтожением ваших растений.

Асептические условия являются ключом к успешному культивированию тканей растений

Специальная среда для выращивания — при культивировании тканей растений создается стерильная питательная среда, которая обеспечивает растения питательными веществами, сахаром, водой и достаточным местом для роста. По сути, питательная среда предоставляет вашему маленькому эксплантату все необходимое, чтобы выжить и превратиться в целое индивидуальное растение. 

Наиболее распространенная среда основана на формуле Murashige & Skoog («MS Medium»), которую можно приготовить дома по рецепту или купить в виде предварительно приготовленного порошка. Формула MS смешивается с дистиллированной водой и сахаром, затем pH доводится до 5,8. Можно выращивать растения непосредственно в этой жидкой среде, но её часто нагревают вместе с загустителем из красных морских водорослей, известным как агар, который превращает жидкую среду для выращивания в гель. Полученная среда для выращивания стерильна и даёт эксплантам место для роста. Кроме того, в среду для выращивания можно включить гормоны растений, чтобы эксплантат рос так, как вы хотите. Например, цитокинин, такой как бензиламинопурин, будет способствовать образованию новых побегов/стеблей/верхушек роста, в то время как гормон ауксинового укоренения, такой как NAA (нафталин-уксусная кислота), может быть смешан для стимулирования укоренения. Растения каннабиса, по-видимому, лучше всего реагируют на цитокинин TDZ (тидиазурон) и ауксины IBA (индол-3-масляная кислота) для укоренения каннабиса и NAA (нафталин-уксусная кислота) плюс TDZ для роста.

При работе со многими видами растений, включая каннабис, нужно сначала заставить эксплантат нарастить новые побеги, используя среду для выращивания с цитокинином. Как только у растения сформируются побеги, вы должны осторожно перенести его в среду для роста, чтобы оно пустило корни. Когда у вас есть полностью сформированное растение, вы можете перенести его в почву или другую традиционную среду для выращивания. Это только начало того, что можно сделать. Культивирование тканей дает вам возможность использовать широкий спектр известных растительных гормонов для получения различных результатов.

В культуре тканей растений формула Murashige & Skoog («среда MS») является основой большинства питательных сред. Среда MS обеспечивает эксплантаты всем необходимым для роста.

Требуется меньше исходного растительного материала — при традиционных методах клонирования каннабиса вам нужно срезать кусочки со стеблями длиной не менее 15 см. Это означает, что каждое зрелое растение может произвести только определенное количество клонов, прежде чем его нужно будет выращивать дальше. Культура тканей позволяет создавать сотни идентичных растений из небольшого кусочка растения или даже отдельных растительных клеток.

Кусочки растений, используемые в культуре тканей, крошечные по сравнению со стеблями, необходимыми для традиционных методов клонирования. Изображение u / Cannomics 

Гормоны растений — вручную добавляя различные гормоны растений в среду для выращивания, вы можете стимулировать свой эксплантат производить различные типы тканей (корни, стебли и т.д.). Это дает вам контроль почти над каждым этапом роста растений.

Гормоны растений, такие как TDZ ( тидиазурон ), добавляются в среду для выращивания, чтобы стимулировать рост эксплантатов каннабиса так, как вы хотите. Хотя покупать TDZ оптом дорого, наборы для культивирования тканей, предназначенные для каннабиса, обычно содержат меньшие количества нужных вам веществ.

Важные соединения для культуры каннабиса

• Цитокинин — растения каннабиса реагируют на цитокинин TDZ (тидиазурон).
• Ауксин — растения каннабиса лучше всего реагируют на ауксин IBA (индол-3-масляную кислоту) для укоренения каннабиса.
• Рост каллуса — может производиться и поддерживаться на растениях каннабиса с помощью комбинации ауксина NAA (нафталин-уксусная кислота) плюс цитокинин TDZ (в концентрации 0,5 мкМ NAA плюс 1,0 мкМ TDZ).
• Укоренение — эксплантаты каннабиса успешно укоренились на среде MS с добавлением 0,1 мг • л ^ -1 IBA и 0,05 мг • л ^ -1 NAA 

Культура тканей создает клоны из небольшого кусочка растения, такого как стебель или лист. Тот же самый общий процесс (стерильные условия плюс стерильная среда для выращивания) также может увеличить скорость прорастания старых семян, предотвращая все загрязнения, обеспечивая при этом идеальные условия для выращивания. 

На картинке ниже — проращивание семян арабидопсиса гровером BlueRidgeKitties в агаре.

Первым известным примером использования культуры растительной ткани, была работа Готлиба Хаберланда в 1898 году, но только в 1950-х годах этот способ получил более широкое распространение в индустрии выращивания орхидей. С тех пор этот процесс стал популярным для всех видов растений во всем мире. Интересно, что с тех пор техника практически не изменилась, хотя теперь информация и материалы доступны большему количеству людей, чем когда-либо.

Культуру тканей можно использовать для…

• размножение клонов с кусочка растения;
• омоложения «уставшего» или болезненного материнского растения;
• удаления эпигенетических мутаций, которые со временем накапливались в растительной ткани;
• устранения болезни, сохраняя при этом генетику;
• половой или бесполой гибридизации посредством выделения протопластов;
• проращивания старых семян;
• производства ботанических веществ;
• мутации и отбора клеток;
• биотехнологии растений;
• соматического эмбриогенез;
• производства синтетических семян.

Вы знали? Можно сохранить генетику автоцветущих растений каннабиса, используя кусочек одного из ранних соцветий, чтобы начать культивирование тканей. Это «возвращает» ткань обратно к образованию стеблей и корней, так что растение может снова вырасти. 

Сложно сохранить генетику автоцветущих растений с помощью обычных методов клонирования. Культура тканей растений позволяет получать «клоны» автоцветущих растений даже после того, как шишки уже полностью сформировались.

Хотел бы я сохранить генетику этого автоцветущего растения Creme de la Chem!

Обзор процесса такого типа культивирования каннабиса — пять этапов микроразмножения

Вот общий обзор всего процесса культивирования тканей растений. Этот раздел поможет вам понять, подходит ли вам метод микроразмножения.

Примечание: на культуру ткани с растениями каннабиса обычно уходит 10–14 недель, прежде чем растения будут готовы к посадке в почву.

1. Определите растение, которое вы хотите использовать.
2. Поместите живую ткань в стерильную среду.
3. Удалите часть растения (этот образец называют эксплантом).
4. Обрежьте эксплант.
5. Очистите эксплант.
6. Поместите эксплантат в продезинфицированную пробирку с подходящей питательной средой (обычно гелем или жидкостью, содержащей питательные вещества и специфические гормоны растений).
7. Позвольте тканям размножаться (превращаться в настоящие растения).
8. Обеспечьте надлежащую температуру, влажность, свет и питательные вещества.
9. Заставить растения пустить корни (так называемое укоренение in vitro).
10. Пересадите в горшок и дайте растениям адаптироваться к внешнему миру.

Следующие изображения культур тканей растений предоставлены доктором Хоупом Джонсом. Спасибо за всё, что вы сделали для сообщества тканевых культур каннабиса!

Удалите часть исходного растения (соберите свои экспланты) и простерилизуйте их.

После стерилизации экспланты необходимо разделить на более мелкие части, каждая из которых содержит только один узел.

Обрезанные экспланты, разрастающиеся новыми побегами в среде для выращивания:

Продолжайте культивировать экспланты каннабиса до тех пор, пока они не дадут здоровые новые побеги.

После того, как эксплантаты вырастили «верхнюю часть» растения, пора переместить их в среду для выращивания корней (чтобы заставить их отрастить корни).

Важные термины:

• Агар — вещество из красных морских водорослей, которое обычно используется для загущения жидкой питательной среды в гель.
• Асептические — стерильные условия, в которых отсутствуют какие-либо живые загрязнители или микроорганизмы, включая насекомых, грибки и бактерии.
• Эксплант — стартовый кусочек растительного вещества. Это часть исходного растения, которое будет размножаться (лист, семя, корни, стебли, цветы и т.д.).
• Формула Мурашиге и Скуга (среда MS) — наиболее распространенная среда, используемая для культивирования тканей. Содержит всё, что нужно растению для роста.
• Стерильная методика — самый важный фактор успеха при культивировании тканей растений (скучно, но факт).
• Тотипотентность — способность растительной клетки делиться и дифференцироваться, что приводит к регенерации в совершенно новый организм.

Термины, которые часто используются как синонимы культуры тканей растений:

• De Novo — выращивание растений из того, что обычно не растет, например, из листьев (de novo означает «заново»).
• Выращивание in vitro — выращивание растений в пробирке или другой подобной среде (in vitro означает «в стекле»).
• Микроразмножение — берут крошечные кусочки растений и заставляют их расти.

По сути, это метод размножения растений путем их вегетативного роста.

Типы культуры:

• культура пыльников (для гаплоидных растений);
• культура зародыша — начиная с зародыша внутри семени;
• каллус и культура клеток — более вероятно, что они будут генетически нестабильными;
• цветочная культура — жизнеспособный способ выращивания растений каннабиса;
• культура меристемы — размножение безвирусными клетками меристемы с верхушек побега.

Эти эксплантаты каннабиса были выращены в маленькие растения. Теперь они будут перенесены в среду для укоренения, чтобы отрастить корни. Изображение предоставлено Skunk Pharm Research

Основные материалы для культивирования тканей:

• Ткань растения — семена каннабиса или кусочек растения каннабис.
• Среда для выращивания — обычно вариант формулы среды Мурашиге и Скуга, иногда в сочетании с такими соединениями, как гормоны растений или агар.
• Пробирки или банки — место для роста растений.

Стерилизация оборудования. Абсолютно стерильная среда является наиболее важным фактором успеха при культивировании тканей растений.

• Скороварка или микроволновая печь.
• Автоклав для тепловой стерилизации под высоким давлением.
• Бытовой отбеливатель или спирт (обычно смешанный с водой).
• Щипцы или пинцет — для захвата и перемещения частей растений.

Освещенное место — яркое место или полочка для роста новых растений.

• Холодные белые или тёплые белые люминесцентные лампы — хорошо подходят лампы T8 для выращивания растений.
• Мягкие светодиодные фонари.

• Источник тепла (плита или горячая плита) — для приготовления среды.
• Набор для проверки pH — проверьте pH с помощью полосок или ручки pH и отрегулируйте с помощью PH Up или PH Down

Чистая вода — либо водоочистное оборудование, либо исключительно чистый источник воды.

• бутилированная дистиллированная вода;
• деионизированная вода;
• вода из обратного осмоса;

Экспланты каннабиса культивируются под флуоресцентным светом. Изображение предоставлено Skunk Pharm Research

Другие полезные и нужные вам предметы:

• Тестер PPM / EC для измерения чистоты воды.
• Прецизионные весы или весы для трёх зерен — точное измерение небольших количеств химикатов. Альтернатива — использовать метод разведения (если вам нужно отмерить 10 мг, смешайте 100 мг с раствором и возьмите 1/10).
• Горячая плита / мешалка. Можно перемешивать вручную, но можно и не работать, лучше с пароваркой. Комбинированная плита с автоматической мешалкой лучше всего.
• Диспенсер медиа: полипропиленовая пипетка 10 мл и термостойкий кувшин из пирекса для заливки горячей среды в пробирки или банки.
• Оборудование для очистки эксплантов: обычно достаточно горячей плиты; также можно использовать плотно закрытую банку; механический шейкер или ротатор.
• Стерилизационное оборудование для инструментов для переноса: окуните в (чистый) спирт, а прогрейте в пламени спирта; отбеливатели — бытовые отбеливатели, содержащие 5,4% гипохлорита натрия. Водный раствор отбеливателя 1:10 для замачивания инструментов, 1: 100 — для полоскания.

Вы должны стерилизовать всё оборудование, прежде чем оно коснется ваших эксплантов. Изображение MicroClone

Где лучше сделать свою лабораторию по культивированию тканей

Чтобы культура ткани работала, необходимо контролировать среду выращивания. Вы получите наилучшие результаты, если обеспечите правильную температуру, влажность, интенсивность света, световой период/фотопериод и питательные вещества. Стремиться нужно к:

• стабильной температуре и возможности регулирования температуры около 21°C/70°F;
• доступ к воде;
• легко содержать в чистоте;
• хорошее качество воздуха без пыли, дыма, плесени, спор или химикатов.

Создайте своё пространство — нужно, чтобы всё было отдельно для максимальной чистоты, но большинство любителей по необходимости хранят всё в одной комнате.

• Место для приготовления раствора— например, кухонный стол.
• Место для переноса культур — например, стеклянный аквариум, перевернутый на бок и заклеенный куском полиэтиленовой пленки. Стерилизуйте пластик раствором отбеливателя или спирта и прорежьте в нём отверстия, чтобы можно было засунуть руки в перчатках.
• Зона для выращивания культур (иногда называемая «первичной комнатой для выращивания»).
• 75–85°F (24–29°C);
• обычно используется световой цикл 16/8;
• циркуляция воздуха для уменьшения горячих точек от света;
• лампа с люминесцентным светом T8 отлично работает.

«Быстрое и простое» руководство по созданию среды для выращивания растений

Все эти ингредиенты можно найти в продуктовом магазине, аптеке и/или магазине здорового питания. Идеально подходит для новичков или тех, кто только начинает заниматься культивированием тканей растений.

Этот рецепт взят из книги «Растения из пробирок: введение в микроразмножение», стр. 77.

Что вам нужно:

• 1/8 стакана столового сахара
• 1 стакан водопроводной воды*
• 1/2 стакана питательного раствора (1/4 чайной ложки универсального удобрения 10-10-10, растворенного в 3,8 л воды)
• Инозитал в таблетке 125 мг (1/2 таблетки 250 мг)
• 1/3 витаминной таблетки с тиамином
• 2 столовые ложки хлопьев агара

* Кокосовое молоко можно заменить водопроводной водой, но рост будет несколько другим (может быть хорошим или плохим в зависимости от типа растения, неизвестно, какое влияние оно оказывает на каннабис)

1. Смешайте ингредиенты в колбе или стакане
2. Варите, помешивая, пока агар не растает.
3. Разлейте среду в консервные банки (или банки для детского питания).
4. Накройте крышкой и готовьте в скороварке в течение 15 минут.
5. Одновременно стерилизуйте пинцет и бритвенные лезвия (оберните алюминиевой фольгой перед тем, как положить в духовку)
6. Также стерилизуйте полулитровые банки с водой (для очистки эксплантата).

Источник: GrowWeedEasy
Перевод: @Terpen

Заинтересовавшимся рекомендую посмотреть видео, демонстрирующее выращивание методом Tissue Culture в лаборатории THC Design:

Еще почитать:

• Один из простейших способов клонирования
• Как выбрать материнское растение?
• Фенохантинг: как происходит отбор лучших растений?